Набор для серологической диагностики бруцеллеза мелкого и крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинции (РНГА)

ИНСТРУКЦИЯ по применению набора для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)

(организация-производитель - ООО «Ветмедсервис», Республика Дагестан, г. Махачкала)

I. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ

1. Набор для серологической диагностики бруцеллеза крупного и мелкого рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (Набор) состоит из следующих компонентов:

- антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА - бесцветная жидкость с осадком эритроцитов, при встряхивании разбивающимся в гомогенную взвесь коричневого или коричнево-красного  цвета;

-взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов - бесцветная про­зрачная жидкость с осадком эритроцитов, при встряхивании разбивающимся в гомогенную взвесь коричневого или коричнево-красного цвета;

- сыворотка бруцеллезная - сухая пористая масса с желтоватым оттенком;

- сыворотка негативная - светло-желтая прозрачная или опалесцирующая жид­кость.

2. Компоненты набора выпускают в стеклянных флаконах или ампулах:

- антиген бруцеллезный эритроцитарный для РНГА в четырех флаконах по 10 см³ или в двух флаконах по 20 см³;

- взвесь формалинизированных несенсибилизированных эритроцитов в двух фла­конах по 5 см³:

- сыворотку бруцеллезную сухую в двух флаконах (ампулах) по 2 см³;

- сыворотку негати вную в двух флаконах (ампулах) по 2 см³,

3.На флаконы (ампулы)  наклеивают этикетки или несмываемой краской наносят клише с указанием: наименования  каждого компонента набора, количества препарата во

флаконе (ампуле), рабочего разведения, номера серии, срока годности.

4. Флаконы (ампулы) с компонентами набора упаковывают в картонные коробки с

разделительными перегородками, обеспечивающими их неподвижность и целостность.

На коробки с набором наклеивают этикетки с указанием: организации- производителя и его товарного знака, наименования набора, перечня компонентов с ука­занием количества во флаконе (ампуле) в см, рабочего разведения и количества флако­нов (ампул), номера серии, номера контроля, даты изготовления, срока годности, условий хранения, надписи "Для животных", обозначения технических условий.

В каждую коробку вкладывают наставление по применению набора.

5. Наборы транспортируют в соответствии с ОСТ 08064-19-07.

6. Срок годности набора 18 месяцев с даты изготовления при условии хранения в сухом темном месте при температуре от 2 до 10 "С.

Набор после истечения срока годности не должен применяться.

7. Компоненты набора во флаконах (ампулах), содержащие посторонние примеси, не разбивающиеся конгломераты, подвергшиеся замораживанию, к применению не при­годны и подлежат выбраковке.

8. Крупный рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, исследуют в сро­ки, предусмотренные инструкциями по применению вакцин.

Мелкий рогатый скот, иммунизированный против бруцеллеза, в РНГА не исследу­ют.

II. БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

9. Антиген бруцеллезный эритроцитарный в РНГА выявляет специфические анти­тела в сыворотке крови инфицированных бруцеллами животных, в контрольной бруцел­лезной сыворотке и не реагирует с контрольной негативной сывороткой.

Компоненты набора не обладают сенсибилизирующими или аллергенными свойствами.

III. ПРИМЕНЕНИЕ ПРЕПАРАТА

10. Подготовка к исследованию

10.1.  Для проведения РНГА необходимы:

- штативы для пробирок Флоринского;

- пробирки Флоринского;

- планшеты 72-х гнездные полистироловые;

- дозаторы групповые Флоринского;

пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 см³;

- дозаторы с наконечниками.

10.2. Полистироловые планшеты подготавливают к работе следующим образом: новые, погружают на 20-30 минут в теплый раствор с моющим средством и каждую лунку моют в этом растворе вращательным движением ватной или ватно-марлевой пробки. Ер­шом не пользуются, во избежание повреждения поверхности лунки. Затем планшеты не менее б раз промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллирован­ной водой и сушат при комнатной температуре или в термостате.

После постановки реакции планшеты выдерживают в 1 %-ном растворе хлорамина или 0,5%-ном растворе фенола 1,5-2,0 часа. В последующем их моют, как указано выше.

Допускается обработка планшетов хромовой смесью в течение суток, после чего их промывают проточной водопроводной водой, ополаскивают дистиллированной водой и сушат.

При работе лицо, руки, одежду защищают от попадания смеси.

10.3. Компоненты реакции:

- сыворотки крови испытуемые;

- сыворотка бруцеллезная сухая;

- сыворотка негативная;

- антиген, бруцеллезный эритроцитарный для РНГА;

- физиологический раствор (0.85%-ный. раствор хлорида натрия в дистиллиро­ванной воде);

- эритроциты формалинизированные несенсибилизированные.

11. Постановка и учет реакции

11.1. Реакцию проводят в объеме 0.55 см³ (0,5 см' разведения сыворотки и 0,05 см³ антигена) с использованием сыворотки крови животных: в четырех последовательно уд­ваивающихся разведениях.

11.2. Для приготовления разведений испытуемых и контрольных сывороток и ра­бочего разведения антигена используют физиологический раствор.

Сыворотку бруцеллезную сухую растворяют в дистиллированной воде (физиоло­гическом растворе), взятой в количестве равном ее объему до высушивания.

11.3 Сыворотки от неиммунизированного или иммунизированного неагглютино- генным противобруцеллезными вакцинами крупного рогатого скота исследуют с разве­дения 1:50. Исходное разведение 1:25 готовят путем внесения 0.1 см³ сыворотки в про­бирки, содержащие 2,4 см³ физиологического раствора.

11.4. Сыворотки от крупного рогатого скота, иммунизированного агглютиноген- ными противобруцеллезными вакцинами, исследуют с разведения 1:100. Исходное разве­дение 1:50 готовят путем внесения 0,1 см³ сыворотки в пробирку с 4,9 см³ физиологиче­ского раствора.

1 1 .5. Сыворотки от мелкого рогатого скота исследуют с разведения 1:25. Исходное

разведение 1:12,5 готовят путем внесения 0,2 см³ сыворотки в пробирки, содержащие 2,3 см³ физиологического  раствора.

Одновременно с испытуемыми сыворотками аналогично готовят разведения кон­трольных сывороток: бруцеллезной и негативной.

Испытуемые и контрольные сыворотки в исходных разведениях в пробирках выдер­живают в водяной бане нагретой  до 60-62 °С в течение 30 минут.

11.6 В лунки первого, второго, третьего и четвертого рядов планшета вносят по 0,5 см 3 физиологического раствора. В лунки первого ряда добавляют по 0,5 см3 испытуемых и контрольных сывороток в исходном разведении.

После смешивания путем пипетирования по 0,5 cm³ разведенных сывороток из лунок первого ряда переносят в лунки второго ряда, из лунок второго-в лунки третьего,

из лунок третьего - в лунки четвертого, из лунок чет­вертого ряда по 0,5 см3 разведенных сывороток удаляют.

     Во все лунки с разведенными сыворотками добавляют по 0,05 см3 антигена в рабочем разведении, которое готовят путем смешивания равных объемов антигена и физиологического

раствора

Содержимое лунок перемешивают путем легкого постукивания по краю планшета до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают при 18-24 °С в те­чение 3,0-4,0 часов и проводят учет реакции.

11.7. При массовых исследованиях, постановку реакции можно проводить с исполь­зованием испытуемых сывороток в одном (исходном) разведении. После прогревания ис­пытуемые и контрольные сыворотки по 0,25 см³ вносят в лунки планшетов и добавляют в них по 0,25 см³ физиологического раствора. В каждую лунку с разведением сыворотки вносят по 0,05 см" антигена в рабочем разведении.

Содержимое лунок перемешивают до получения равномерной взвеси антигена в сыворотке, выдерживают 11.8. В случае пол; крови животных в одном при  18-24 °С в течение 3,0-4,0 часов и проводят учет реакции.

11.8. В случае получения положительного результата при исследовании сыворотки крови животных в одном  разведении, для определения титра гемагглютининов. РНГА ста­вят в четырех разведениях, при этом исходное разведение каждой испытуемой сыворотки готовят заново.

При перестановке позитивных проб сыворотки крови ставят контроль на отсутст­вие гемагглютинационных свойств. Для этого к 0,25 см³ каждой из испытуемых проб инактивированной сыворотки крови в исходном разведении добавляют 0,25 см ' физиоло­гического раствора и 0,05 см³ взвеси несенсибилизированных эритроцитов в рабочем раз­ведении (1 объем несенсибилизированных эритроцитов + 1 объем физиологического раствора).

Результат контроля должен быть отрицательным. При получении положительной реакции, данную пробу исследуют в РА и РИД или в РА, РСК и РИД,

Допускается: постановка реакции в два этапа: накануне готовят исходные разведе­ния испытуемых и контрольных проб сыворотки крови, прогревают при указанном выше режиме, хранят при 2-8 °С и На следующий День исследуют. 11.8. Учет реакции

Учет РНГА проводят визуально и оценивают в крестах по следующей схеме:

"++++" (4 креста) - 100 %-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хо­рошо выраженного "зонтика" покрывает все дно лунки, возможно сползание и заворачи­вание краев агглютината в виде "зонтика".

"+++" (три креста) - 75 %-ная агглютинация эритроцитов, агглютинат в виде хо­рошо выраженного "зонтика" меньшего диаметра, чем при оценке реакции на 4 креста. В центре лунки возможно образование с трудом различаемого кольца из осевших неагглютинированных эритроцитов.

"++" (два креста) — 50 %-ная агглютинация эритроцитов, осевшие неагглютинированные эритроциты образуют на дне лунки ровное кольцо с зернистостью вокруг него.

 ^«+" (1 крест) - на дне лунки кольцо коричнево-красного цвета.

 '-" (минус) - эритроциты оседают в виде компактной "пуговки" или колечка.

За титр антител принимают наибольшее разведение сыворотки, в котором про­изошла агглютинация эритроцитов с оценкой 4 или 3 креста. Реакции с оценкой 2 креста (++), 1 крест (+) и минус. (-) считают отрицательными.

12.Диагностическая оценка реакции

12.1. В благополучных и неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, неиммунизированного или иммунизированного неаглютиногенными вакцинами, животных, сыворотка крови которых дает в РНГА положительную реакцию в разведении 1:100 считают больными бруцеллезом, в разведении 1:50 - сомнительно реагирующими.

С больными животными поступают в соответствии с Санитарными правилами СП 3.1. 085-96 и Ветеринарными правилами ВП 13.3. 1302-96. Профилактика и борьба с за­разными болезнями, общими для человека и животных. Бруцеллез.

Сомнительно реагирующих животных исследуют повторно через 15-30 дней в РНГА, РА, РСК и РИД. При повышении титра антител в РНГА или положительных ре­зультатах РА и (или) РСК и (или) РИД. заболевание считают установленным. При сохра­нении или снижении титра в РНГА и отрицательных результатах других реакций животных считают здоровыми.

12.2. В благополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, иммунизи­рованного  агглютиногенными вакцинами, животных, сыворотка крови которых дает в РИГА положительную реакцию в разведении 1:400 и выше считают больными. Живот­ных, сыворотка крови которых положительно реагирует в РНГА в разведении не выше 1:200, исследуют в РА. РСК и РИД. При получении отрицательных реакций, этих живот­ных через 15-30 дней повторно исследуют в РНГА, РА. РСК и РИД . При сохранении или снижении титра антител в РНГА и отрицательных РА, РСК и РИД животных считают здоровыми, при повышении титра антител в РИГА, независимо от результатов исследова­ния в РА, РСК или РИД - больными бруцеллезом.

12.3. В неблагополучных по бруцеллезу стадах крупного рогатого скота, иммуни­зированного против бруцеллеза, животных, сыворотка крови которых дает в РНГА поло­жительную реакцию в разведении 1: 200 и выше, считают больными бруцеллезом, в разве­дении 1:300 - сомнительно реагирующими.

Сомнительно реагирующих животных исследуют повторно через 15-30 дней в РНГА. РА, РСК и РИД. При повышении титра в РНГА или положительных результатах РА и (или) РСК и (или) РИД, заболевание считают установленным. При сохранении или снижении титра в РНГА и отрицательных результатах других, реакций животных считают здоровыми.

12.4. В благополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота отарах животных, сыворотка крови которых положительно реагирует в РНГА в разведении 1:100 считают больными; 1:50 и 1:25 - сомнительно реагирующими.

Сомнительно реагирующих животных через 15-30 дней исследуют повторно в РНГА, РА. РСК и РИД. При сохранении титра в РНГА на прежнем уровне и отрицатель­ных РА, РСК и РИД животных считают здоровыми.

При повышении титра антител в РНГА и (или) положительных результатах в РА и (или) в РСК и (или) в РИД заболевание бруцеллезом считают установленным.

12.5. В неблагополучных по бруцеллезу мелкого рогатого скота отарах, животных, сыворотка крови которых положительно реагирует в РНГА в разведении 1:50 и выше, считают больными, а 1:25 - сомнительно реагирующими.

Сомнительно реагирующих животных исследуют повторно через 15-30 дней в РНГА, РА. РСК и РИД. При повышении титра в РНГА или положи­тельных результатах РА и (или) РСК и (или) РИД, заболевание считают уста­новленным. При сохранении или снижении титра в РНГА и отрицательных результатах других реакций животных считают здоровыми.

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

13. Компоненты набора безопасны для здоровья людей.

Меры личной безопасности сводятся к соблюдению санитарно-гигиенических пра­вил работы с биологическим материалом.

14. В случае попадания компонентов Набора на открытые участки тела или слизи­стые оболочки, их моют водой с мылом.

15. Набор следует хранить в местах, недоступных для детей. Инструкция разработана  ООО «Ветмедсервис». Юридический адрес 367000,

Республика Дагестан, г. Махачкала, ул. Дахадаева, д. 88.

Рекомендовано к применению и регистрации в Российской Федерации ФГУ «ВГНКИ».

Регистрационный номер - ПВР-1 -1.6/01643