Набор эритроцитарного диагностикума для серодиагностики вирусной диареи КРС в реакции непрямой гемагглютинции (РНГА)

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Методические указания по применению набора эритроцитарного дигпюстикума для серодиагностики вурусной диареи крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинации (РНГА)

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Специфически ВД эритроцитарный антиген и контрольный эритроцитарный антиген представляют собой прозрачную жидкость с осадком эритроцитов коричневого или бурого цвета, образующих при встряхивании гомогенную взвесь буро-коричневого цвета. Антигены расфасованы в виде 3%-ной суспензии эритроцитов по 5 мл в ампуле.

На этикетках ампул с эритроцитарными антигенами указаны: название препарата, количество препарата в ампуле, номер серии, дата изготовления. Специфическая и отрицательная сыворотка крови крупного рогатого скота и сыворотка крови кролика для разба­вителя по внешнему виду представляют собой сухую гомогенную аморфную массу или опалесцируюшую жидкость соломенно-жел­того цвета без признаков гемолиза, расфасованы по 1 мл в ампулу.

На этикетках ампул с сыворотками указаны: название сыворотки, количество сыворотки в ампуле, номер серии, дата изготовле­ния. Ампулы с эритроцитарными антигенами и сыворотками упакованы в коробки с разделительными перегородками, обеспечиваю­щими неподвижность и целостность ампул. В каждую коробку вкладывают наставление по применению набора. Набор рассчитан на 100 исследований. Срок годности набора 6 месяцев со дня изготовления при условии хранения в закрытых помещениях в сухом темном месте при температуре от 2 до 10° С. Не допускается замораживание набора.

2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

2.1. Для проведения исследований в лабораторию направляют не менее 15-20 проб сывороток крови от больных и переболевших животных в начале заболевания и через 3-4 недели.

2.2. Сыворотки хранят при температуре от 4 до 8° С не более недели или при минус 20° С в течение месяца.

2.3. Гемолизированные, проросшие или консервированные сыворотки для исследования не пригодны.

3. ПОДГОТОВКА НАБОРА К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

3.1. Ампулы с эритроцитарными антигенами тщательно встряхивают до получения однородной взвеси, вскрывают и разводят разбавителем (на 1 мл антигена добавляют 2 мл разбавителя). В качестве разбавителя используют 0,15М фосфатно-буферный физиоло­гический раствор pH 7,2-7,4, с добавлением нормальной сыворотки кролика в количестве 1% от объема буфера.

3.2. Приготовление 0,15М фосфатно-буферного физиологического раствора pH 7,2-7,4: в мерную колбу 1 л вносят 20,4 г химически чистого безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до метки 1 литр (раствор А). В другую мерную колбу на 1 литр вносят 26,7 г химически чистого двузамещенного фосфорнокислого натрия-двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят до метки 1 литр (раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 4-8°С в течение месяца. Для приготовления буфера к 24 мл раствора А добавляют 76 мл раствора Б и вносят 0,85 г химически чистого хлористого натрия. С помощью pH-метра проверяют pH буфера и при необходимости доводят до pH 7,2-7,4 растворами А или Б.

3.3. Приготовление разбавителя: к 100 мл буфера добавляют 1 мл нормальной сыворотки крови кролика. Для этого ампулу с сухой сывороткой встряхивают, вносят в нее 1 мл дистиллированной воды, растворяют содержимое ампулы и переносят в буфер. Затем раз­бавитель прогревают при температуре 65-66° С в течение 40 минут, дают остыть при комнатной температуре, добавляют 0,3 мл фор­малина и фильтруют через бумажный фильтр. Хранят разбавитель при комнатной температуре в течение месяца. При появлении мути на дне сосуда с разбавителем его снова фильтруют. Мутный разбавитель не используют.

4. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

4.1. РНГА ставят с использованием микропланшета с U-образнымн лунками наборов для микротитрования «Ткачи» или «Титертек». В лунку микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя. В первые лунки каждого ряда вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 мл. На каждую исследуемую сыворотку необходимо два ряда лунок. Последующими переносами получают дву­кратные разведения сывороток от 1:2 до 1:256. Затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического ВД эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена. Панель встряхи­вают, закрывают специальной крышкой и на 18-24 часа ставят в холодильник при температуре от 4 до 8° С. Одновременно ставят контроли:

а) контроль на отсутствие спонтанной агглютинации специфического и контрольного эритроцитарного антигенов. В два ряда лунок вносят по 0,05 мл разбавителя, затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического ВД эритроци­тарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;

б) контроль на отсутствие агглютинации специфического ВД эритроцитарного антигена и контрольного эритроцитарного антигена отрицательной сывороткой крупного рогатого скота. В два ряда лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первые лунки вносят по 0,05 мл отрицательной сыворотки крупного рогатого скота и титруют. Затем в первый ряд вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического ВД эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;

в) контроль на активность специфического ВД эритроцитарного антигена с специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл специфической сыворотки и титруют, как исследуемые сыворотки, затем вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического ВД эритроцитарного антигена;

г) контроль специфической сыворотки на наличие антител к контрольному эритроцитарному антигену. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл специфической к ВД сыворотки и титруют, затем вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарно­го антигена.

5. УЧЕТ РЕАКЦИИ

5.1. Реакцию учитывают на следующий день. За титр антител в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки .дающее четкую агглютинацию (зонт).

5.2. Учёт реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.

5.3. Контроли реакции. В контрольных лунках на спонтанную агглютинацию эритроциты должны осесть в виде точки или плотного кольца. Титр отрицательной сыворотки со специфическим ВД эритроцнтарным антигеном и с контрольным антигеном не должен превышать 1:4. Титр антител специфической сыворотки со специфическим ВД эритроцитарным антигеном должен быть не ниже 1:128, а с контрольным эритроцнтарным антигеном не выше 1:8.

5.4. Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивают по титрам и в зависимости от наличия антител к контрольному эритроцитарному антигену: при наличии в испытуемых сыворотках антител к контрольному эритроцитарному антигену в титрах не выше 1:4, положительными считают сыворотки, дающие со специфическим к ВД эритроцнтарным антигеном титры 1:16 и выше. При наличии в испытуемых сыворотках антител с контрольным эритроцитарным антигеном в титрах более 1:8, положи­тельными считают сыворотки, которые со специфическим к ВД эритроцитарным антигеном дали титры в 4 и более раз выше. Увеличение титров в парных сыворотках в 4 раза и выше, а также увеличение числа серопозитивных сывороток свидетельствует о наличии инфекции.