Набор эритроцитарного дигностикума для серодиагностики аденовирусной инфекции КРС в реакции непрямой гемагглютинции (РНГА)

МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ

Методические указания по применению набора эритроцитарного диагностикума для серодиагностики аденовирусной ин­фекции крупного рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинаиии (РНГА) ТУ-10-19-372-92

1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Специфический аденовирусный эритроцитарный антиген и контрольный эритроцитарный антиген представляют собой прозрачную жидкость с осадком эритроцитов коричневого, или бурого цвета, образующих при встряхивании гомогенную взвесь буро-коричневого цвета. Антигены расфасованы в виде 3%-ной суспензии эритроцитов по 5 мл в ампуле.

На этикетках ампул с эритроцитарными антигенами указаны: название препарата, количество препарата в ампуле, номер серии, дата изготовления. Специфическая и отрицательная сыворотки крови крупного рогатого скота и сыворотка крови кролика для разбавителя по внешнему виду представляют собой сухую гомогенную аморфную массу или опалесцирующую жидкость соло­менно-желтого цвета без признаков гемолиза, расфасованы по 1 мл в ампулу.

На этикетках ампул с сыворотками указаны: название сыворотки, количество сыворотки в ампуле, номер серии, дата изго­товления. Ампулы с эритроцитарными антигенами и сыворотками упакованы в коробки с разделительными перегородками, обеспе­чивающими неподвижность и целостность ампул. В каждую коробку вкладывают наставление по применению набора. Набор рас­считан на 100 исследований. Срок годности набора 6 месяцев со дня изготовления при условии хранения в закрытых помещениях в сухом темном месте при температуре от 2 до 10° С. Не допускается замораживание набора.

2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

2.1. Для проведения исследований в лабораторию направляют не менее 15-20 проб сывороток крови от больных и перебо­левших животных в начале заболевания и через 3-4 недели.

2.2. Сыворотки хранят при температуре от 4 до 8° С не более недели или при минус 20° С в течение месяца.

2.3. Гемолизированные, проросшие или консервированные сыворотки для исследования не пригодны.

3. ПОДГОТОВКА НАБОРА К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ

3.1. Ампулы с эритроцитарными антигенами тщательно встряхивают до получения однородной взвеси, вскрывают и разво­дят разбавителем (на 1мл антигена добавляют 2 мл разбавителя). В качестве разбавителя используют 0,15М фосфатно-буферный физиологический раствор рН 7,2-7,4 с добавлением нормальной сыворотки кролика в количестве 1% от объема буфера.

3.2. Приготовление 0,15М фосфатно-буферного физиологического раствора рН 7,2-7,4: в мерную колбу 1 л. вносят 20,4 г хи­мически чистого безводного однозамещенного фосфорнокислого калия, в небольшом количестве дистиллированной воды и доводят водой до метки I литр (Раствор А). В другую мерную колбу на 1 л вносят 26,7 г химически чистого двузамещенного фосфорнокис­лого натрия-двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят до метки 1 литр (Раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 4-8° С в течение месяца. Для приготовления буфера к 24 мл раствора А добавляют 76 мл раствора Б и вно­сят 0,85 г химически чистого хлористого натрия. С помощью рН-метра проверяют рН буфера и при необходимости доводят до рН 7,2-7,4 растворами А или Б.

3.3. Приготовление разбавителя: к 100 мл буфера добавляют 1 мл нормальной сыворотки крови кролика. Для этого ампулу с сухой сывороткой встряхивают, вносят в нее 1 мл. дистиллированной воды, растворяют содержимое ампулы и переносят в буфер. Затем разбавитель прогревают при температуре 65-66°С в течение 40 минут, дают остыть при комнатной температуре, добавляют 0,3 мл формалина и фильтруют.

4. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ

4.1. РНГА ставят с использованием микропанелей с U-образными лунками наборов для микротитрования "Такачи" или "Титартек". В лунки микропанели вносят по 0,05 разбавителя. В первые лунки каждого ряда вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 мл. На каждую исследуемую сыворотку необходимо два ряда лунок. Последующими переносами получают двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1:256. Затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического аденовирусного эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена. Панель встряхивают, закрывают специальной крышкой и на 18-24 часа ставят в холодильник при температуре от 4 до 8° С. Одновременно ставят контроли:

а) контроль на отсутствие спонтанной агглютинации специфического и контрольного эритроцитарного антигенов. В два ряда лунок вносят по 0,05 мл разбавителя, затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси, специфического аденовирусного эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;

б) контроль на отсутствие агглютинации специфического аденовирусного эритроцитарного антигена и контрольного эритроцитарного антигена отрицательной сывороткой крупного рогатого скота. В два ряда лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первые лунки вносят по 0,05 мл отрицательной сыворотки крупного рогатого скота и титруют. Затем в первый ряд вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического аденовирусного эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;

в) контроль на активность специфического аденовирусного эритроцитарного антигена с специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл специфической сыворотки, и титруют как исследуемые сыворотки, затем вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического аденовирусного эритроцитарного антигена;

г) контроль специфической сыворотки на наличие антител к контрольному эритроцитарному антигену. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, затем в первую лунку вносят по 0,05 мл специфической к аденовирусу сыворотки и титруют, затем вносят по 0,025 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена.

5. УЧЕТ РЕАКЦИИ

5.1. Реакцию учитывают на следующий день. За титр антител в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки, дающее четкую агглютинацию (зонт).

5.2. Учет реакции проводят только при условии четких результатов, полученных в контролях.

5.3. Контроли реакции. В контрольных лунках на спонтанную агглютинацию эритроциты должны осесть в виде точки плотного кольца. Титр отрицательной сыворотки со специфическим аденовирусным эритроцитарным антигеном и с контрольным антигеном не должен превышать 1:4. Титр антител специфической сыворотки со специфическим аденовирусным эритроцитарным антигеном должен быть не ниже 1:128, а с контрольным эритроцитаным антигеном не выше 1:8.

5.4. Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками оценивают по титрам и, в зависимости от наличия антител к контрольному эритроцитарному антигену, при наличии в испытуемых сыворотках антител к контрольному эритроцитарному антигену в титpax не выше 1:8, положительными считают сыворотки, дающие со специфическим к аденовирусу эритроцитарным антигеном ти­тры 1:16 и выше. При наличии в испытуемых сыворотках антител с контрольным эритроцитарным антигеном в титрах более 1:8 положительными считают сыворотки, которые со специфическим к аденовирусу эритроцитарным антигеном дали титры в 4 и более раз выше.