МИНИСТЕРСТВО СЕЛЬСКОГО ХОЗЯЙСТВА
РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Методические указания по применению набора
эритроцитарного диагностикума для серодиагностики аденовирусной инфекции крупного
рогатого скота в реакции непрямой гемагглютинаиии (РНГА) ТУ-10-19-372-92
1. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Специфический аденовирусный эритроцитарный антиген и контрольный
эритроцитарный антиген представляют собой прозрачную жидкость с осадком эритроцитов
коричневого, или бурого цвета, образующих при встряхивании гомогенную взвесь буро-коричневого
цвета. Антигены расфасованы в виде 3%-ной суспензии эритроцитов по 5 мл в ампуле.
На этикетках ампул с эритроцитарными антигенами указаны:
название препарата, количество препарата в ампуле, номер серии, дата изготовления.
Специфическая и отрицательная сыворотки крови крупного рогатого скота и сыворотка
крови кролика для разбавителя по внешнему виду представляют собой сухую гомогенную
аморфную массу или опалесцирующую жидкость соломенно-желтого цвета без признаков
гемолиза, расфасованы по 1 мл в ампулу.
На этикетках ампул с сыворотками указаны: название сыворотки,
количество сыворотки в ампуле, номер серии, дата изготовления. Ампулы с эритроцитарными
антигенами и сыворотками упакованы в коробки с разделительными перегородками, обеспечивающими
неподвижность и целостность ампул. В каждую коробку вкладывают наставление по применению
набора. Набор рассчитан на 100 исследований. Срок годности набора 6 месяцев со
дня изготовления при условии хранения в закрытых помещениях в сухом темном месте
при температуре от 2 до 10° С. Не допускается замораживание набора.
2. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ
2.1. Для проведения исследований в лабораторию направляют
не менее 15-20 проб сывороток крови от больных и переболевших животных в начале
заболевания и через 3-4 недели.
2.2. Сыворотки хранят при температуре от 4 до 8° С не более
недели или при минус 20° С в течение месяца.
2.3. Гемолизированные, проросшие или консервированные сыворотки
для исследования не пригодны.
3. ПОДГОТОВКА НАБОРА К ИСПОЛЬЗОВАНИЮ
3.1. Ампулы с эритроцитарными антигенами тщательно встряхивают
до получения однородной взвеси, вскрывают и разводят разбавителем (на 1мл антигена
добавляют 2 мл разбавителя). В качестве разбавителя используют 0,15М фосфатно-буферный
физиологический раствор рН 7,2-7,4 с добавлением нормальной сыворотки кролика в
количестве 1% от объема буфера.
3.2. Приготовление 0,15М фосфатно-буферного физиологического
раствора рН 7,2-7,4: в мерную колбу 1 л. вносят 20,4 г химически чистого безводного
однозамещенного фосфорнокислого калия, в небольшом количестве дистиллированной воды
и доводят водой до метки I литр (Раствор А). В другую мерную колбу на 1 л вносят 26,7 г химически чистого двузамещенного
фосфорнокислого натрия-двуводного, растворяют в небольшом количестве воды и доводят
до метки 1 литр
(Раствор Б). Растворы А и Б можно хранить при температуре 4-8° С в течение месяца.
Для приготовления буфера к 24 мл раствора А добавляют 76 мл раствора Б и вносят
0,85 г химически
чистого хлористого натрия. С помощью рН-метра проверяют рН буфера и при необходимости
доводят до рН 7,2-7,4 растворами А или Б.
3.3. Приготовление разбавителя: к 100 мл буфера добавляют
1 мл нормальной сыворотки крови кролика. Для этого ампулу с сухой сывороткой встряхивают,
вносят в нее 1 мл. дистиллированной воды, растворяют содержимое ампулы и переносят
в буфер. Затем разбавитель прогревают при температуре 65-66°С в течение 40 минут,
дают остыть при комнатной температуре, добавляют 0,3 мл формалина и фильтруют.
4. ПОСТАНОВКА РЕАКЦИИ
4.1. РНГА ставят с использованием микропанелей с
U-образными лунками наборов для микротитрования "Такачи" или
"Титартек". В лунки микропанели вносят по 0,05 разбавителя. В первые
лунки каждого ряда вносят исследуемые сыворотки в количестве 0,05 мл. На каждую
исследуемую сыворотку необходимо два ряда лунок. Последующими переносами
получают двукратные разведения сывороток от 1:2 до 1:256. Затем в первый ряд
лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси специфического аденовирусного
эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси
контрольного эритроцитарного антигена. Панель встряхивают, закрывают
специальной крышкой и на 18-24 часа ставят в холодильник при температуре от 4
до 8° С. Одновременно ставят контроли:
а) контроль
на отсутствие спонтанной агглютинации специфического и контрольного
эритроцитарного антигенов. В два ряда лунок вносят по 0,05 мл разбавителя,
затем в первый ряд лунок вносят по 0,025 мл 1%-ной взвеси, специфического
аденовирусного эритроцитарного антигена, а во второй ряд по 0,025 мл 1%-ной
взвеси контрольного эритроцитарного антигена;
б) контроль на отсутствие агглютинации специфического
аденовирусного эритроцитарного антигена и контрольного эритроцитарного антигена
отрицательной сывороткой крупного рогатого скота. В два ряда лунок микропанели
вносят по 0,05 мл разбавителя, в первые лунки вносят по 0,05 мл отрицательной
сыворотки крупного рогатого скота и титруют. Затем в первый ряд вносят по 0,025
мл 1%-ной взвеси специфического аденовирусного эритроцитарного антигена, а во
второй ряд по 0,025 мл 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена;
в) контроль
на активность специфического аденовирусного эритроцитарного антигена с
специфической сывороткой крупного рогатого скота. В ряд лунок микропанели
вносят по 0,05 мл разбавителя, в первую лунку вносят 0,05 мл специфической
сыворотки, и титруют как исследуемые сыворотки, затем вносят по 0,025 мл 1%-ной
взвеси специфического аденовирусного эритроцитарного антигена;
г) контроль
специфической сыворотки на наличие антител к контрольному эритроцитарному
антигену. В ряд лунок микропанели вносят по 0,05 мл разбавителя, затем в первую
лунку вносят по 0,05 мл специфической к аденовирусу сыворотки и титруют, затем
вносят по 0,025 1%-ной взвеси контрольного эритроцитарного антигена.
5. УЧЕТ РЕАКЦИИ
5.1. Реакцию учитывают на следующий день. За титр
антител в РНГА принимают наивысшее разведение сыворотки, дающее четкую
агглютинацию (зонт).
5.2. Учет реакции проводят только при условии четких
результатов, полученных в контролях.
5.3. Контроли реакции. В контрольных лунках на
спонтанную агглютинацию эритроциты должны осесть в виде точки плотного кольца.
Титр отрицательной сыворотки со специфическим аденовирусным эритроцитарным
антигеном и с контрольным антигеном не должен превышать 1:4. Титр антител
специфической сыворотки со специфическим аденовирусным эритроцитарным антигеном
должен быть не ниже 1:128, а с контрольным эритроцитаным антигеном не выше 1:8.
5.4. Результаты РНГА с испытуемыми сыворотками
оценивают по титрам и, в зависимости от наличия антител к контрольному
эритроцитарному антигену, при наличии в испытуемых сыворотках антител к
контрольному эритроцитарному антигену в титpax не выше 1:8, положительными
считают сыворотки, дающие со специфическим к аденовирусу эритроцитарным
антигеном титры 1:16 и выше. При наличии в испытуемых сыворотках антител с
контрольным эритроцитарным антигеном в титрах более 1:8 положительными считают
сыворотки, которые со специфическим к аденовирусу эритроцитарным антигеном дали
титры в 4 и более раз выше.